考点47 基因工程

一轮复习讲义,选修三 2018-03-01

1.基因工程的基本工具:限制酶、DNA连接酶、基因的运载体
    如果问工具酶,必须答限制酶和DNA连接酶。

2.限制酶
    (1)全称:限制性核酸内切酶
    酶:催化作用、高效性、专一性、作用条件较温和。
    限制性:它们能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
    内切:区分外切酶,从DNA的内部进行切割。
    核酸外切酶是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解磷酸二酯键,降解核苷酸的酶。其水解的最终产物是单个的核苷酸(DNA为dNMP,RNA为NMP)。按作用的特性差异可以将其分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶。
    (2)来源:制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。
    提问:原核生物有限制酶,原核生物有没有DNA?
    (3)为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA?
    微生物在长期的进化过程中,含有某种限制酶的细胞,其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列,或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上,使限制酶不能将其切开。
    (4)限制酶断开的是磷酸二酯键,画磷酸二酯键。
47-1.png
    (5)黏性末端:当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时,产生的是黏性末端。
    平末端:当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时,产生的则是平末端。
    (6)大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成,也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成。多为回文序列
    提问:限制酶的识别位点和切割位点是否相同?
    (7)(不讲)我们高中阶段学的都是第二型限制酶,所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列。但是第一型限制酶和第三型限制酶识别位点和切割位点不同。
    (8)单酶切(分析结果)
47-2.png
    (9)双酶切(分析结果)
47-3.png
3.DNA连接酶:通过图1-4说明DNA连接酶的作用。DNA连接酶的种类及区别。
    E·coli DNA连接酶:只能将双链DNA片段互补的粘性末端之间连接起来,不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。
    T4 DNA 连接酶:既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端,又可以连接双链DNA片段的平末端,但连接平末端的效率比较低。
4.基因的运载体
    (1)基因工程常用载体:质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等
    (2)质粒:质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外,并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。
    (3)作为基因的运载体应具备的条件
        ①有一个至多个限制酶切割位点。
        ②在细胞中进行自我复制,或整合到染色体DNA上,随染色体DNA进行同步复制。
        ③载体上有特殊的标记基因,供重组DNA的鉴定和选择
        ④安全:载体DNA 必需是安全的,不会对受体细胞有害,或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。
        ⑤大小应适合:载体DNA分子大小应适合,以便提取和在体外进行操作,太大就不便操作。
    (4)在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒,都是在天然质粒的基础上进行 过人工改造的。

基因工程的基本操作程序
5.目的基因的获取
    ①从基因文库中获取目的基因
    将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。
    将某种生物体内的DNA全部提取出来,选用适当的限制酶,将DNA切成一定范围大小的DNA片段,然后,将这些DNA片段分别与载体连接起来,导入受体菌的群体中储存,每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。也就是说,这个群体包含了这种生物的所有基因,叫做这种生物的基因组文库。
    如果用某种生物生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段,与载体连接后储存在一个受体菌群中,那么,这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。
基因组文库和部分基因文库.png

    介绍如何从基因文库中获取目的基因。
    ②利用PCR技术扩增目的基因
    ③通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成
6.基因表达载体的构建
    基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步,也是基因工程的核心。
    启动子:启动子是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,它是RNA聚合酶识别和结合的部位。
    终止子:终止子相当于一盏红色信号灯,使转录在所需要的地方停止下来。终止子位于基因的尾端,也是一段有特殊结构的DNA短片段。
    标记基因:标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来,如抗生素抗性基因就可以作为这种基因。
    复制原点
7.将目的基因导入受体细胞
    转化:目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程,称为转化。
    将目的基因导入植物细胞
    农杆菌转化法
    基因枪法
     花粉管通道法
    将目的基因导入动物细胞
     显微注射技术
    将目的基因导入微生物细胞
     感受态细胞法(Ca2+处理法)
8.目的基因的检测与鉴定
     ①要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因。
     ②检测目的基因是否转录出了mRNA。
    ③检测目的基因是否翻译成蛋白质。
    ④进行个体生物学水平的鉴定。
9.基因工程的应用
    强调乳腺生物反应器、动物作为器官移植的供体、基因工程药物、基因治疗
10.蛋白质工程
    蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成,对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质,以满足人类的生产和生活的需求。
    基因工程的实质:将一种生物的基因转移到另一种生物体内,后者可以产生它本不能产生的蛋白质,进而表现出新的性状,这就是基因工程的实质。
    基因工程的局限性:基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的,它们的结构和功能符合特定物种生存的需要,却不一定完全符合人类生产和生活的需要。
    基本途径:从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)
    难点:蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构,这种高级结构十分复杂,而目前科学家对大多数蛋白质的高级结构的了解还很不够,要设计出更加符合人类需要的蛋白质还需经过艰辛的探索。

11.影印接种法
    影印接种法最初是为证明微生物的抗药性突变是自发的、与相应的环境因素无关而设计的实验,目前已广泛应用于营养缺陷型的筛选以及抗药性菌株筛选等研究工作中。
    具体过程是:将待测的浓缩菌悬液涂在合适的平板上,等其长好后作为母平板(每平板上的菌落控制在50~300个);用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上,构成印章(即接种工具);然后把长有菌落的母平板倒置在丝绒的印章上,轻轻印一下;再把此印章在另一含有选择培养基的平板上轻轻印一下,经培养后,选择培养基平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置对应,比较影印平板与母平板上菌落生长情况,即可从相应位置的母平板上选出待测的突变型菌落。影印法最初是为证明微生物的抗药性突变是自发的、与相应的环境因素无关而设计的实验,目前已广泛应用于营养缺陷型的筛选以及抗药性菌株筛选等研究工作中。
    大本P247面
(2016全国课标卷Ⅰ,40) 15分
    某一质粒载体如图所示,外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后,与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混合物直接转化大肠杆菌,结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题:
47-4.png
(1)质粒载体作为基因工程的工具,应具备的基本条件有________________________________________________(答出两点即可),而作为基因表达载体,除满足上述基本条件外,还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选,在上述四种大肠杆菌细胞中,未被转化的的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的,其原因是_______________________________________________________;并且_____________________和____________________的细胞也是不能区分的,其原因是____________________________________________________。
在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落,还需使用含有____________________的固体培养基。
(3)基因工程中,某些噬菌体经改造后可以作为载体,其DNA复制所需的原料来自于____________________。

答案:40.(1)能自我复制(具有复制原点)、具有标记基因
(2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因,在该培养基上均不生长  含有质粒载体 
含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒)
二者均含有氨芐青霉素抗性基因,在该培养基上均能生长  四环素
(3)受体细胞

12.测序(双脱氧链终止法)
    核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时,如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基,只要双脱氧碱基掺入链端,该链就停止延长,链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端,以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后,分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基),根据片段3’端的双脱氧碱基,便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

47-5.png


本文由 刘道占 创作,采用 知识共享署名 3.0,可自由转载、引用,但需署名作者且注明文章出处。

还不快抢沙发

添加新评论

icon_mrgreen.gificon_neutral.gificon_twisted.gificon_arrow.gificon_eek.gificon_smile.gificon_confused.gificon_cool.gificon_evil.gificon_biggrin.gificon_idea.gificon_redface.gificon_razz.gificon_rolleyes.gificon_wink.gificon_cry.gificon_surprised.gificon_lol.gificon_mad.gificon_sad.gificon_exclaim.gificon_question.gif